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Quais as plataformas de sequenciação disponíveis na Genoinseq?

A Genoinseq fornece serviços de sequenciação de última geração com as plataformas Ion Proton™ (Ion Torrent™, Thermo Fisher Scientific), e MiSeq® e NextSeq® (Illumina®).


Onde poderei obter mais informação sobre os sistemas de sequenciação Ion Proton e MiSeq/NextSeq?

Informação adicional sobre estas tecnologias e equipamentos pode ser consultada nos sites web das empresas detentoras dos equipamentos: www.thermofisher.com e www.illumina.com


Que tipos de sequenciação de DNA são disponibilizados pela Genoinseq?

Os serviços da Genoinseq incluem sequenciação de novo e re-sequenciação de genomas, sequenciação de exomas, sequenciação para a descoberta de microssatélites, sequenciação de amplicões, sequenciação de plasmídeos, fosmídeos ou vírus, sequenciação para estudos de taxonomia em comunidades microbianas e metagenómica. 


Quais as diferenças entre os vários tipos de sequenciação de DNA?

A sequenciação de genomas de novo permite a obtenção da informação genética codificada no DNA, enquanto a re-sequenciação visa a identificação de alterações genéticas entre indivíduos. A sequenciação de exomas permite a identificação das alterações genéticas nas regiões codificantes do genoma, informação esta que pode ser utilizada na procura de mutações associadas a doença.

A descoberta de microssatélites é efetuada por sequenciação de uma fração aleatória do genoma do organismo e a posterior identificação de potenciais microssatélites com recurso a ferramentas bioinformáticas.

A sequenciação de amplicões visa a deteção de alterações em genes já conhecidos. Esta abordagem permite a identificação de mutações em genes associados a doenças.

Nos estudos de comunidades biológicas, a identificação taxonómica de organismos é efetuada pela sequenciação de uma parte de um gene específico, geralmente o gene 16S rRNA para bactérias e ITS (Internal Transcribed Spacer) para fungos. Nestes estudos, a diversidade e composição das comunidades é definida pela identificação dos microrganismos cultiváveis e não cultiváveis presentes na amostra ambiental. Esta abordagem também pode ser aplicada a comunidades eucarióticas. Neste caso, os genes 18S rRNA e citocromo oxidase I (COI) podem ser utilizados.

A sequenciação de metagenomas permite o estudo do conjunto de genomas de uma determinada comunidade ambiental ou amostra complexa sem ter de se efetuar o isolamento dos organismos existentes na comunidade e o seu estudo individual.

A sequenciação de genomas de novo ou re-sequenciação, a descoberta de microssatélites e metagenómica têm objetivos diferentes mas utilizam princípios técnicos semelhantes. A biblioteca de sequenciação é preparada pela clivagem do DNA genómico em pequenos fragmentos e ligação de adaptadores de sequenciação às extremidades de cada fragmento. Por outro lado, os estudos de taxonomia de comunidade e sequenciação de amplicões requerem a amplificação de um gene ou conjunto de genes alvo para cada amostra.


Que plataformas são utilizadas para fazer a sequenciação de DNA?

A Genoinseq fornece os seus serviços de sequenciação de larga escala utilizando o Ion Proton™ (Ion Torrent™, Thermo Fisher Scientific), e o MiSeq® e NextSeq®(Illumina). Após análise detalhada do projeto, é determinada a plataforma apropriada para dar a melhor resposta às necessidades do projeto e requisitos do cliente.


A Genoinseq disponibiliza serviços de extração de DNA?

A Genoinseq disponibiliza este serviço e tem implementados protocolos otimizados para isolamento de DNA a partir de diferentes tipos de amostras biológicas. A qualidade elevada do DNA nas amostras é essencial para a obtenção de bons resultados de sequenciação. 


Que métodos para quantificação e avaliação da qualidade das amostras de DNA sugerem?

A quantificação do DNA deverá ser feita por fluorometria (p.e. Qubit dsDNA HS Kit Assay). A quantificação por espectrofotometria (p.e  Nanodrop) é imprecisa e não é adequada para este tipo de sequenciação. A quantificação pode ser influenciada pela presença de DNA de cadeia simples, RNA e outras moléculas contaminantes. No entanto, a determinação das razões de OD260/280 e OD260/230 é recomendada para a avaliação do grau de pureza das amostras (p.e. Nanodrop). A integridade do DNA deve ser verificada por eletroforese (p.e gel de agarose).


Qual a quantidade e qualidade requerida para as amostras de DNA?

A quantidade varia dependendo da aplicação e esta deve ser determinada por fluorometria. A pureza e integridade da amostra são cruciais para obter bons resultados de sequenciação. Razões de OD260/280 e OD260/230 entre 1,75 e 1,95 são recomendados.


E se a amostra de DNA não cumprir os requisitos mínimos de concentração e/ou qualidade?

Nesta situação, sugerimos que contacte a Genoinseq para que juntos possamos encontrar a melhor solução para o seu projeto.


Que plataformas são utilizados para fazer a sequenciação de RNA?

A Genoinseq fornece serviços de sequenciação de RNA utilizando o MiSeq® e o NextSeq® ((Illumina®). Após análise detalhada do projeto, é determinada a plataforma apropriada para dar a melhor resposta às necessidades do projeto e requisitos do cliente.


Que tipos de sequenciação de RNA são disponibilizados pela Genoinseq?

A Genoinseq fornece vários serviços de sequenciação de RNA, nomeadamente Sequenciação do transcriptoma total, RNA mensageiro, assim como pequenos e micro RNAs.


Quais as diferenças entre os vários tipos de sequenciação de RNA?

Dependendo do serviço de sequenciação de RNA requisitado, são utilizados métodos distintos de enriquecimento de RNA.

A sequenciação do transcriptoma completo permite a caracterização de todos os transcritos de RNA, codificante e não codificante, de um dado organismo ou comunidade. Uma vez que o RNA ribossomal representa a grande maioria do transcriptoma, é necessária proceder à depleção de rRNA antes da preparação da biblioteca para sequenciação.

A sequenciação de RNA mensageiro tem como objetivo a caracterização de transcritos pelo enriquecimento baseado na cauda poli-adenilada, característica deste tipo de RNAs. Para procariotas, apenas a abordagem de depleção do RNA ribossomal poderá ser aplicada, uma vez que os seus transcritos não são poli-adenilados.

A sequenciação de pequenos (< 200nt) e micro (10-40 nt) RNAs abrange a porção dos transcritos pequenos não codificantes do transcriptoma.


É possível caracterizar os pequenos e micro RNAs na sequenciação do transcriptoma total?

Devido ao tamanho dos pequenos e micro RNAs, estes não poderão ser incluídos na sequenciação do transcriptoma completo. Se pretende sequenciar pequenos (<200nt) e micro RNAs (10-40nt) deve fazer uma extração de RNA que favoreça o enriquecimento nestas moléculas e optar pelo serviço de sequenciação de pequenos RNAs.


A preparação da biblioteca de RNA mantém a orientação da cadeia dos transcritos (strand-specific)?

O procedimento da preparação da biblioteca mantém a informação acerca da orientação da cadeia dos transcritos de RNA. Utilizando um protocolo strand-specific, é possível caracterizar e quantificar os transcritos que se sobrepõem e que advêm de cadeias diferentes, o que não seria possível com um protocolo não-direcionado. A identificação da cadeia de DNA molde permite aumentar a confiança na anotação dos transcritos e a deteção de expressão de transcritos em antisense.


Como devo isolar RNA?

O método de isolamento de RNA adotado deve extrair todas as espécies de RNA, incluindo pequenos RNAs. De forma a obter bons resultados de sequenciação, é essencial que as amostras de RNA apresentem uma elevada qualidade, sendo necessário adotar procedimentos de manipulação apropriados a este tipo de material. O RNA purificado deve ser preferencialmente eluído ou dissolvido em água livre de nucleases (nuclease-free water).

Se pretender fazer a sequenciação de pequenos/micro RNAs recomendamos que utilize um kit de extração que favoreça o isolamento destas espécies. 


Não consigo obter a quantidade mínima de RNA requerida. Como devo proceder?

Por favor, contacte os nossos serviços. A Genoinseq pode ajudar na resolução de pequenos problemas ou sugerir protocolos alternativos de preparação de bibliotecas a partir de quantidades limitadas de RNA.


Que procedimentos tem a Genoinseq para verificar a qualidade do RNA enviado?

Todas as amostras recebidas são sujeitas a um processo de controlo de qualidade antes de se proceder à preparação da biblioteca. É verificada a pureza através da medição das razões de OD260/280 e OD260/230 (p.e. Nanodrop), a integridade pela determinação do RIN (RNA Integrity Number) por eletroforese capilar (p.e. Bioanalyzer) e efetuada a sua quantificação por método fluorométrico (p.e. Qubit RNA HS Assay Kit).


Porque razão devem os RNAs ter RIN > 8?

Quanto maior o valor de RIN (RNA Integrity Number), melhor a qualidade dos dados de sequenciação obtidos. Valores de RIN baixos indicam degradação de RNA, principalmente RNA ribossomal. Estes fragmentos de rRNA serão sequenciados em conjunto com o mRNA, levando a uma diminuição da cobertura de sequenciação dos transcritos de interesse diminuindo desta forma, a qualidade dos resultados de sequenciação. A Genoinseq recomenda um RIN superior a 8 para qualquer das abordagens de sequenciação.


Porque devo tratar a amostra de RNA com DNase?

O DNA contaminante será sequenciado como parte integrante da biblioteca preparada. Recomenda-se a utilização de um método de isolamento com incorporação de tratamento com DNase.


Que procedimentos são efetuados às amostras de RNA na Genoinseq?

Após receção da amostra e verificação dos dados submetidos e enviados, transferimos imediatamente a amostra para um congelador a -80ºC. Receberá um email a confirmar a receção da amostra.


A Genoinseq disponibiliza serviço de Genotipagem?

A Genoinseq disponibiliza serviços de genotipagem para genes humanos e de outros organismos. O serviço pode incluir o estudo de SNPs de um ou vários genes. No caso de um número elevado de genes, a genotipagem é efetuada por sequenciação em larga escala. 


Como é feita a análise dos dados?

A Bioinformática é parte integrante da plataforma de sequenciação da Genoinseq. Temos implementadas pipelines para o processamento e para a análise dos dados de sequenciação. Estas pipelines estão otimizadas para dotar cada projeto com a análise mais apropriada e assim dar resposta às questões biológicas ou clínicas de cada cliente. Damos ênfase especial ao desenvolvimento e disponibilização de formatos “amigos do utilizador” para aceder ou analisar os resultados. 


Como posso aceder aos resultados da sequenciação?

Todos os dados relevantes do projeto, tais como o objetivo, estratégia, metodologia, tarefas e resultados serão organizados num relatório final entregue em formato digital. Os resultados de sequenciação são organizados em ficheiros e disponibilizados na Cloud da Genoinseq. 


Para que morada devo enviar as minhas amostras?

Por favor envie as suas amostras juntamente com uma cópia do formulário de Submissão de Projeto para:

Genoinseq
UC-Biotech
Parque Tecnológico de Cantanhede, Núcleo 04, Lote 8
3060-197 Cantanhede
Portugal

Posso obter um acordo de confidencialidade (CDA/NDA)?

Sim, temos disponíveis modelos de acordos de confidencialidade, ou poderemos assinar, após revisão, um acordo de confidencialidade da empresa/ instituto do cliente.


Sou detentor da propriedade intelectual dos meus resultados?

Sim, como prestadores de serviços, não reivindicamos qualquer propriedade intelectual.


Não encontro resposta para as minhas dúvidas?

Se não encontrou resposta para as suas dúvidas por favor contactar a Genoinseq via email genoinseq(at)biocant.pt ou pelo telefone (+) 351 231249170. 

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